Elabscience乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性比色法測(cè)試盒(E-BC-K771-M)可用于以乳酸脫氫酶(LDH)釋放為指標(biāo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)。

檢測(cè)原理：

乳酸脫氫酶催化乳酸和 NAD+反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸和 NADH，NADH在PMS作用下，將電子傳遞給 WST-8，產(chǎn)生黃色的產(chǎn)物，其在450 nm有特征吸收峰，從而可以通過比色法來定量乳酸脫氫酶的活性。

操作步驟：

樣本處理：

① 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板根據(jù)以下分類加樣(每一種分類至少三個(gè)復(fù)孔)：

空白孔：100 μL 無細(xì)胞的培養(yǎng)液(推薦使用含 1%血清的低血清或無血

清培養(yǎng)液)；

樣本對(duì)照孔：100 μL 待檢測(cè)細(xì)胞(約含 5000-10000 個(gè)細(xì)胞)；

最大酶活對(duì)照孔：100 μL 待檢測(cè)細(xì)胞(約含 5000-10000 個(gè)細(xì)胞)；

樣本測(cè)定孔：100 μL 待檢測(cè)細(xì)胞(約含 5000-10000 個(gè)細(xì)胞)；

② 將 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于 37°C，含 5% CO2空氣及 100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h。

③ 向步驟②中的空白孔，樣本對(duì)照孔中分別加入 10μL 的培養(yǎng)液向步驟②中的樣本測(cè)定孔中加入 10 μL 不同濃度的藥物刺激。

④ 37°C，含 5% CO2 空氣及 100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)細(xì)胞需求選擇適當(dāng)?shù)姆跤龡l件和時(shí)間)。

⑤ 在結(jié)束培養(yǎng)前 1h 從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在最大酶活對(duì)照孔中加入 10 μL 的試劑一，并反復(fù)吹打混勻；

⑥ 37°C，含 5%CO2空氣及 100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 1 h；

⑦ 將 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板用酶標(biāo)板離心機(jī) 400 x g 離心 5 min，吸取上清液待測(cè)。

注：若無酶標(biāo)板離心機(jī)，可將細(xì)胞液用移液槍吸打均勻后，移取至離心

管中，使用普通離心機(jī)離心

樣本檢測(cè)：

① 取 96 孔酶標(biāo)板，按上述細(xì)胞培養(yǎng)過程劃分為空白孔、樣本對(duì)照孔、最大酶活對(duì)照孔和樣本測(cè)定孔，然后向各孔中加入50μL對(duì)應(yīng)的待測(cè)上清液。

② 向步驟①酶標(biāo)板各孔中加入50μL反應(yīng)工作液，酶標(biāo)儀震板5 s混勻。

③ 37°C，孵育10 min；(反應(yīng)時(shí)間可根據(jù)顯色深淺延長或縮短，建議測(cè)定多個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的OD值，以便于篩選，盡量控制樣品對(duì)照孔的OD值小于0.8，最大酶活對(duì)照孔的OD值小于 2.0)。

④ 向步驟③中各孔加入 20μL試劑五，混勻，終止反應(yīng)。

⑤ 酶標(biāo)儀上450 nm 波長處測(cè)定各孔OD值，并設(shè)定600 nm參比波長，扣除參比波長的OD值，為所需有效吸光度值

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